Ziehl-Neelsen

La tinción de Ziehl-Neelsen (BAAR) es una técnica de tinción diferencial rápida y económica, para la identificación de microorganismos patógenos, por ejemplo M. tuberculosis.

Fue descrita por primera vez por dos médicos alemanes, Franz Ziehl, un bacteriólogo y Friedrich Neelsen, un patólogo.

·         Fundamento

Las paredes celulares de ciertos parásitos y bacterias contienen ácidos grasos (ácidos micólicos) de cadena larga (50 a 90 átomos de carbono) que les confieren la propiedad de resistir la decoloracíón con alcohol-ácido, después de la tinción con colorantes básicos. Por esto se denominan ácido-alcohol resistentes. Las micobacterias como M. tuberculosis y M. marinum y los parásitos coccídeos como Cryptosporidium se caracterizan por sus propiedades de ácido-alcohol resistencia. La coloración clásica de Ziehl-Neelsen requiere calentamiento para que el colorante atraviese la pared bacteriana que contiene ceras. Al suspender el calentamiento y enfriar con agua, provoca una nueva solidificación de lo ácidos grasos de modo que el colorante ya no puede salir de las bacterias. Por otro lado, el calentamiento aumenta la energía cinética de las moléculas del colorante lo cual también facilita su entrada a las bacterias. Las bacterias que resisten la decoloración son de color rojo y la que no se ven de color azul, ya que se utiliza azul de metileno como tinción de contraste

Fundamento: los BAAR poseen una pared celular rica en lípidos y ácidos carboxílicos (ácido micólico) que tienen la propiedad de unirse excepcionalmente fuerte al colorante 1rio (fuscina de Ziehl) cuando se usa el calor como mordiente. Una vez que se forma este complejo colorante-pared, ni siquiera la acción conjunta del ácido y del alcohol pueden deshacerlo, ya que las paredes retienen el colorante en forma "resistente".

·         Técnica

Se realiza el frotis. Se aplica el colorante 1rio sobre la muestra y se deja reposar. Luego se emplea la llama de un mechero para calentar la muestra hasta la aparición de vapores blancos. El calor se emplea como mordiente, gracias al calor los lípidos de la pared dejan pasar el colorante para que se combine con los ácidos carboxílicos de la pared, así se forma el complejo colorante-pared. Se deja reposar y se lava con agua. Las bacterias que no han formado el complejo en su pared (no BAAR) no retendrán el colorante, el exceso del mismo será arrastrado por el agua. Se aplica el colorante 2rio, se deja reposar y se lava con agua.

Coloración en caliente (Técnica de Ziehl-Neelsen): emplea el calor como mordiente para formar el complejo colorante-pared. Es la técnica recién descrita. La principal desventaja consiste en que se puede llevar a cabo una decoloración en caliente (tiempo prolongado). Esta consiste en aplicar el decolorante ácido-alcohol y luego calentar la muestra, la capa lipídica se ablanda y el decolorante puede atravesar la pared celular retirando el decolorante 1rio y revirtiendo el proceso de formación del complejo colorante-pared. Por esto se dice que la coloración en caliente no brinda resultados diferenciales.

Coloración en frío (Técnica de Kinyoun): utiliza un reactivo especial que además de fuscina agrega una ↑ [Fenol]. El fenol disuelve los lípidos de las paredes celulares permitiendo que el colorante 1rio entre el contacto con los ácidos carboxílicos y forme el complejo ácido-alcohol resistente. Esta técnica permite obtener resultados diferenciales ya que no es posible la decoloración en caliente.